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    蛋白質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時間: 2022-12-01  點(diǎn)擊次數(shù): 800次

    簡介

    蛋白質(zhì)分離的方法主要有 3 種:SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)、免疫沉淀法分離蛋白質(zhì)和雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)。

    原理

    SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)的基本原理是蛋白質(zhì)在 SDS 和巰基乙醇的作用下,分子中的二硫鍵還原,氫鍵打開,形成帶負(fù)電荷的 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,聚丙烯酰胺(PAGE)是一種具有三維結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀高分子聚合物,具有分子篩的作用。蛋白質(zhì)在 PAGE 電泳中向正極遷移,遷移速率取決于分子的大小、電荷及其空間結(jié)構(gòu)。SDS 帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷,不同的蛋白質(zhì)與之結(jié)合后具有相同的荷質(zhì)比,并具有相似的空間構(gòu)象,使得 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在 PAGE 中的遷移速率只與蛋白質(zhì)的分子大小相關(guān)。
    免疫沉淀法分離蛋白質(zhì)的基本原理是是利用特異的抗體從細(xì)胞裂解物中分離目的蛋白的一種沉淀方法。該方法首先要制備細(xì)胞裂解液,然后將特異性抗體加到細(xì)胞裂解液中,4 ℃ 下孵育一定時間后,再加入可以與特異性抗體結(jié)合的固相化分子使之形成不溶性抗原-抗體復(fù)合物而沉淀。將沉淀下來的抗原-抗體復(fù)合物在含有 SDS 和 DTT 的緩沖液中加熱后,使被沉淀的抗原釋放出來,經(jīng)電泳分離后即可用各種方法檢測。

    雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個一級屬性-等電點(diǎn)和分子質(zhì)量的特異性,將蛋白質(zhì)混合物在電荷(等電聚焦,IEF)和分子質(zhì)量(變性聚丙烯酰胺凝胺電泳,SDS-PAGE)兩個水平上進(jìn)行分離。2D-PAGE 的第一向電泳是等電聚焦電泳(IEF),蛋白質(zhì)因所帶凈電荷的不同而被分離開;然后對蛋白質(zhì)進(jìn)行第二向電泳-SDS-PAGE,在 SDS-PAGE 中,不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)相互間分離開。由于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和所帶凈電荷是兩個彼此不相關(guān)的重要性質(zhì),而 2D-PAGE 同時利用了蛋白質(zhì)間在這兩個性質(zhì)上的差異分離蛋白質(zhì)。



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