按照PCR技術的演進，我們可以將PCR技術大致劃分為三代：傳統PCR技術，實時熒光定量PCR技術和數字PCR技術。

第一代：傳統PCR技術

聚合酶鏈式反應（PCR）的基本原理是利用DNA聚合酶在特定條件下復制特定DNA片段，通過反復的循環(huán)，這個特定的DNA片段可以被大量復制或放大。PCR過程主要包括以下三個步驟：

• 變性（Denaturation）：在高溫（通常為94-96°C）下，DNA雙鏈被分離成兩條單鏈。這是因為DNA雙鏈之間的氫鍵在高溫下會斷裂。

• 退火（Annealing）：降低溫度（通常在50-65°C），使得人工合成的、與目標DNA序列互補的短DNA片段（即引物）能夠與分離后的DNA單鏈結合。

• 延伸（Extension）：升高溫度（通常為72°C），DNA聚合酶開始在引物的末端添加相應的核苷酸，以此按照DNA的互補配對原則復制DNA。

這種“變性—退火—延伸"就是一個PCR循環(huán)，每個循環(huán)都會使目標 DNA 序列的數量翻倍。使得DNA片段在短時間內能以2n倍進行擴增，這樣就可以生成數百萬到數十億份的目標 DNA 序列。PCR的反應流程大致如下：

傳統的PCR技術通常試管內進行，這個過程通常被反復進行30-40次，每次循環(huán)都會使目標DNA序列的數量翻倍。這樣，即使開始時只有極少量的目標DNA，也可以在幾個小時內得到足夠數量的DNA片段。并且需要人工改變每個循環(huán)的溫度變化，過程耗時且容易出錯。

然而，傳統的PCR技術也有一些局限性。例如，它不能提供關于目標DNA數量的實時信息，也不能進行精確的定量分析。

第二代：實時熒光定量PCR技術（qPCR）

傳統的PCR技術主要用于定性檢測，即判斷目標DNA序列是否存在。但在許多研究和應用中，人們需要知道目標DNA的具體數量，例如在基因表達分析、病原體檢測、基因編輯效率評估等場景。因此傳統的PCR技術通常需要在反應結束后通過電泳或其他方法來檢測和分析結果，這大大增加了實驗的復雜性和時間。為了解決這一問題，實時熒光PCR問世了。實時熒光PCR是一種革新性的DNA定量技術，其基本原理與傳統的PCR相同，都是通過熱循環(huán)引發(fā)DNA的去鏈和復制。然而，實時熒光PCR的特別之處在于，在PCR過程中，反應體系中添加了能夠發(fā)射熒光信號的熒光標記物，使得PCR的擴增過程能夠被實時監(jiān)測。

新一代的熒光標記物如SYBR Green，其與雙鏈DNA（dsDNA）的結合能力遠超過溴化乙二胺，能產生強烈的熒光信號。這種特性不僅提升了PCR檢測的靈敏度，而且有助于縮短PCR實驗的總體周期。在PCR過程中，每當DNA分子被復制一次，SYBR Green就會與新產生的DNA分子結合，發(fā)射出熒光信號。因此，熒光信號的強度就可以直接反映出當前擴增的DNA數量。

但SYBR Green又有新的問題，那就是無法區(qū)分不同的DNA序列。針對需要高特異性檢測的場合，研究者們開發(fā)了一系列與特定DNA序列結合的熒光探針，如雙標記探針（TaqMan探針）、分子信標、Scorpions探針和LightCycler探針等。這些探針的設計原理是，一端連接熒光染料（reporter），另一端連接猝滅劑（quencher）。在PCR反應中，這些探針會與目標DNA序列特異性結合，由于熒光染料和猝滅劑距離近，熒光會被猝滅。然而，當DNA聚合酶在延伸新的DNA鏈時，它會分解探針，使熒光染料與猝滅劑之間的距離增大，從而產生熒光信號。

第三代：數字熒光PCR

數字PCR（DigitalPCR，dPCR）的發(fā)展源于對更準確、更靈敏的分子檢測方法的需求。雖然實時定量PCR（qPCR）已經廣泛應用于基因表達分析、病原體檢測等領域，但是它存在一些局限性，比如需要標準曲線進行定量，對樣本純度和PCR效率有較高的要求，而且對于罕見突變和低豐度目標分子的檢測靈敏度不夠。

數字PCR（dPCR）是一種新型PCR技術，它通過將樣品稀釋并分配到數百到數百萬個微小的反應室中，每個反應室中包含零個或一個模板拷貝。然后在每個反應室中獨立進行PCR反應，并通過檢測每個反應室的熒光信號來確定是否存在目標分子。這種方法可以直接計算出樣品中的目標分子數量，而不需要像qPCR那樣依賴標準曲線。

數字PCR是一種精確且敏感的分子生物學技術，專門用于測量DNA或RNA的數量。其主要優(yōu)勢在于具有高精度和高靈敏度，能夠直接計算樣品中的目標分子數量，并對低豐度的目標分子進行高效檢測。并且數字PCR不需要依賴標準曲線或參照基因，這減少了實驗偏差，使其能夠在復雜樣本中準確地進行定量。但數字PCR也有缺點，其中包括實驗操作的復雜性、設備成本高昂，以及相對較低的樣本處理能力。

小結

聚合酶鏈式反應（PCR）技術自1983年發(fā)明以來，已逐漸成為生命科學研究和臨床分子診斷領域的核心技術。PCR技術的發(fā)展歷程經歷了傳統PCR、實時熒光定量PCR（qPCR）以及數字PCR（dPCR）三個重要階段，每個階段的技術突破和優(yōu)化都為DNA的檢測和分析提供了更準確、更靈敏和更高效的解決方案。

PCR技術的發(fā)展和應用不僅深刻地改變了生命科學研究的面貌，而且在臨床診斷、環(huán)境和食品安全監(jiān)測、藥物發(fā)現以及藥物療效監(jiān)測等領域都發(fā)揮著至關重要的作用。然而，盡管PCR技術已經取得了顯著的成就，但在提升PCR技術的靈敏度、準確性和穩(wěn)定性，以及降低PCR實驗的復雜性和成本等方面，我們仍面臨著一些挑戰(zhàn)。為了應對這些挑戰(zhàn)，科學家們正在進行大量的研究工作，并已經取得了一些重要的突破。我們有理由相信，隨著科技的進步，PCR技術將在未來的生命科學研究和臨床應用中發(fā)揮更大的作用，為人類社會帶來更多可能性和福祉。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩(wěn)定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產品和物流服務。 專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持，隨時為客戶提供服務。